一、检测原理
本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗 硝基咪唑抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，硝基咪唑抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的硝基咪唑竞争性地与硝基咪唑抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的硝基咪唑浓度与吸收光强度成反比。
二、检测范围
本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出蜂蜜中的硝基咪唑类药物。
四、试剂盒组成
酶标板1块，96孔/板
标准液6瓶（绿盖）：1ml/瓶
0 ppb、0.05ppb、0.2ppb、0.8ppb、3.2ppb、12.8ppb
高标准液1瓶（红盖）：100 ppb ………………1ml/瓶
抗体工作液 (蓝盖)………………………………7ml
酶标记物 (红盖)…………………………………12ml
底物液A (白盖)……………………………………7ml
底物液B(黑盖) ……………………………………7ml
终止液(黄盖) ………………………………………7ml
20X浓缩洗涤液(透明盖)…………………………40 ml
2X浓缩复溶液(黄盖)……………………………50 ml
说明书………………………………………………1份
五、 需要但试剂盒中不提供的器材和试剂
（1）设备
微孔板酶标仪(450nm)
振荡器、离心机
微量移液器：20μl～200μl,100μl~1000μl
容量瓶：100ml，500ml，1000ml
试剂
    NaOH、无水碳酸钠、碳酸氢钠、正己烷、乙酸乙酯
六、溶液的配制
    样本前处理需配制：
配液1：pH 10.6   0.1M   碳酸盐缓冲液
称取4.66g无水碳酸钠，0.5g碳酸氢钠去离子水500ml溶解。
配液2：2M 氢氧化钠溶液
称取40g氢氧化钠，加入去离子水500ml溶解。
配液3：复溶工作液
2X浓缩复溶液在使用前请按1：1稀释，配制成复溶工作液。
（1份浓缩复溶液+1份去离子水）
配液4：洗涤液
将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释。
20X浓缩洗涤液在使用前请按1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水）。可按需配置，稀释后的洗涤液可在4℃保存一个月。
七、样本前处理方法
    样本处理前须知
    处理任何样本时，都须注意：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
    样本处理步骤：
蜂蜜（样本稀释倍数0.5）
（1）取3g蜂蜜，加3ml 0.1M 碳酸盐缓冲溶液振荡至蜂蜜全部溶解；
（2）加入9ml 乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（3）取上层有机相6ml至另一离心管中，加入2ml乙酸乙酯，2ml 2M氢氧化钠溶液，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（4）取4ml清澈上层有机相至干净玻璃试管中，56℃水浴氮气/空气吹干；
（5）加入正己烷1ml，涡动30s，再加入0.5ml复溶工作液混合30秒，室温4000转/分以上，离心5分钟；
（6）去除上层有机相，取下层50?l液体用于分析。
八、酶联免疫检测步骤
测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用该板膜盖住微孔板。
测定步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30分钟，抗体不用在室温下平衡，4℃取出立即点样；每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
2、加标准品/样本50?l /孔，再加入抗体工作液50?l/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，4℃环境避光反应1小时。
3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250l/孔，每次浸泡15~30秒，充分洗涤4－5次，用吸水纸拍干。
4、加酶标记物每孔100μl，用盖板膜盖好，25℃下避光反应30分钟。取出酶标板，重复步骤3；
5、显色：每孔先各加入底物液A 50μl，再各加入底物液B 50μl，轻轻晃荡混匀，并在25℃下避光反应15分钟。
6、读数：每孔各加50μl终止液，在酶标仪于450nm处测定OD值（建议用450/630nm双波长检测，在5分钟内读完数据）。
九、结果分析    
所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以第一个标准液（0标准液）的吸光度（B0）值再乘以100%，得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝B/B0 ×100%
以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含磺胺类药物的量。
利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十、试剂盒灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.05ppb
 样本最低检测限：
       蜂蜜样本…………………………………………0.1ppb
回收率：
蜂蜜样本 …………………………………………90±10%
精密度：
         试剂盒的变异系数均小于10%
十一、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）
会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准
曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应
立即进行下一步操作。
3、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴漏到皮
肤上，请尽快用水冲洗。
4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
5、保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封
袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
7、在加入底物液后，一般显色15分钟即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20分钟（或更长），但不得超过30分钟。反之，则减短反应时间。
8、该试剂盒加标准品、抗体工作液的最佳反应温度为4℃，加酶标记物与显色步骤的最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十二、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
保存期：本试剂盒有效期为12个月。