原理
本实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳仅能分成5~7个组份，而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12~30个组份。
操作
(一)凝胶柱的制备：
1．取已准备好的10×0.6cm的玻管，从一端量至7cm处，用玻璃腊笔划线。起始端用胶布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。
2．分离胶的制备：
(1)按分离胶配制表的比例(附后)，取1号、2号试剂和蒸馏水加入一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为分离胶溶液(此溶液约在半小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶，故应尽快操作。如室温较高时，为防止过快聚合，可放置冰浴中操作。或根据聚合速度的快慢，适当调整TEMED的加入量)。
(2)用5ml注射器、18号针头或用长细滴管吸取分离胶溶液，将其沿玻管管壁注入玻管，直至7cm划线平面。
(3)用长细滴管吸取蒸馏水，沿管壁在分离胶的液面上加注0.5cm高的水层。加水时必须缓慢细流，尽量减少胶液表面的震动与混合。(加注水层是为了使凝胶聚合后的表面平整而不致出现弯月形，并能使凝胶与空气隔绝。这一步很重要，它将直接影响分辨率与带形)。
(4)将加注好的凝胶管静置1小时，以进行聚合反应。在聚合过程中，起初凝胶与水层的界面逐渐消失，待胶体形成后，其界面又将重新可辨。这一现象可用来观察判断凝胶的聚合是否完成。
3．浓缩胶的制备
(1)按浓缩胶配制表的比例取2号、5号试剂和蒸馏水加入另一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为浓缩胶溶液。(在制备浓缩胶时，也常用核黄素催化的光聚合来代替过硫酸铵催化的化学聚合作用)。
(2)用滴管和滤纸小心地吸去已聚合好的分离胶胶面上的水液。注意切勿触及胶面。
(3)用长细滴管或注射器吸取浓缩胶溶液，在分离胶胶面上沿玻管壁小地注入0.5~1cm高的胶液。然后同样沿玻管壁缓慢细流地加入0.5cm高的蒸馏水。静置一小时后即可使用。
在加样之前先用滴管或滤纸小心地吸去浓缩胶胶面上的水液。
(二)加样：
用50μl的微量注射器，取12μl血清，加12μl的40%蔗糖溶液(1∶1稀释)，再加入40μl0.05%溴酚兰指示剂，混匀。每管中加入该混合液16μl，共可加4管。每管实际加入纯血清3μl，含蛋白质196μg。(血清蛋白质含量为6.2克/100毫升血清)
若需增减管数，亦照此加样比例推算。
(三)电泳
(1)将加样完毕的凝胶管上端垂直插入上电极槽底板的橡胶塞孔中。并去掉下端的橡皮塞和胶布。
(2)先用长细滴管吸取电极缓冲液，在已插好的凝胶管样品液面上，小心地逐管加满电极缓冲液。然后将电极缓冲液慢慢地倒入上、下电极槽中。注意避免和排除凝胶管的上、下管口内留有气泡，否则会影响导电。电极缓冲液的加入量，上槽以电极能完全浸入为宜，下槽以凝胶管浸入3/5为宜。
阅读： 2016-04-21 16:04:16
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